急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的白血病类型，约占所有急性白血病病例的70%。尽管治疗策略有所改进，但AML通常进展迅速，大多数患者最终会对治疗产生耐药或复发。因此，需要更好地了解白血病发生的分子机制，以便确定新的治疗靶点和开发改进的治疗药物。
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N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳动物mRNA上丰度最高的修饰，广泛参与了RNA的剪接、转运、降解和翻译等过程的调控。一些证据表明，m6A修饰机制的失调与多种类型的癌症有关，包括AML。在人体内，m6A修饰主要由甲基转移酶复合物催化完成，其中METTL3和METTL14为核心成员。METTL16是近期发现的一种m6A甲基转移酶，但其在AML和正常造血中的作用还有待研究。
近日，美国希望之城贝克曼研究所邓晓岚、陈建军和苏瑞团队与中国医科大学药学院魏敏杰团队合作，发现METTL16对AML细胞的生存至关重要，其重要程度高于METTL3和METTL14。它通过重塑支链氨基酸（BCAA）的代谢来驱动白血病发生和白血病干细胞自我更新。这项研究成果于2023年1月5日发表在《Cell Stem Cell》杂志上。
研究材料与方法
在这项研究中，研究人员使用了原发性AML患者和健康对照的样本，分离出白血病母细胞和单核细胞开展分析。使用Mettl16fl/fl小鼠（赛业生物提供构建）与Mx1-Cre小鼠杂交后产生的Mettl16条件性基因敲除（cKO）小鼠探究Mettl16与AML的关系。研究者采用了全基因组范围的CRISPR筛选，并使用了基于慢病毒的shRNA系统。随后通过m6A-seq和RNA-seq来寻找METTL16的靶点，并通过三重四级杆质谱分析来检测m6A水平。
技术路线
01 对多个癌细胞系进行CRISPR基因敲除筛选，发现METTL16的重要性
02 敲除细胞和小鼠中的METTL16，以确定其对AML发生和进展的影响
03 分析METTL16对正常造血过程的影响
04 确定METTL16的作用靶点，以分析其在AML中的作用机制
研究结果
1 METTL16是AML进展和维持所必需的
目前，除了METTL3和METTL14外，大多数METTL蛋白在正常生理过程和发病机制中的作用仍不清楚。研究人员在分析800多个癌细胞系的全基因组CRISPR-Cas9基因敲除筛选数据后，发现白血病对METTL16的依赖性比其他癌症类型更强，同时AML细胞系对METTL16的依赖性比非AML细胞系更强。让研究者惊讶的是，在所有METTL成员中，对AML细胞的生存和增殖而言最重要的竟然是METTL16。此外，METTL16在人类AML样本中异常过表达，无论是mRNA水平还是蛋白水平。
为了阐明METTL16在白血病发生中的作用，研究人员委托赛业生物构建了Mettl16fl/fl小鼠并与Mx1-Cre小鼠杂交，产生了Mettl16条件性基因敲除（cKO）小鼠。研究者发现，Mettl16的杂合子敲除显著延迟了白血病的发生和进展，延长了生存期，而Mettl16的纯合子敲除则表现出更明显的抗白血病活性，完全抑制了白血病发生（图1）。人源性肿瘤异种移植（PDX）模型上的分析结果进一步证实了这一点，表明METTL16在AML的发生、进展和维持中发挥关键的致癌作用。
2 METTL16对LSC/LIC的自我更新至关重要
同时，研究人员还发现，原发性AML患者样本中的METTL16蛋白水平显著高于健康对照，特别是在白血病干细胞（LSC）和白血病起始细胞（LIC）中，这意味着METTL16可能在LSC/LIC的自我更新中起作用。利用shRNA敲低Mettl16后，研究者观察到人类原发性AML细胞的集落形成能力受到抑制，而小鼠上开展的分析也获得了类似的结果，表明METTL16对于维持LSC/LIC的自我更新至关重要。
为了确定METTL16是否是AML治疗时的潜在安全靶点，研究人员接下来分析了它在正常造血过程中的作用。研究者使用Mettl16 cKO小鼠模型，用poly（I:C）诱导了血液学特异性Mettl16敲除，发现纯合子敲除导致外周血中的白细胞、淋巴瘤细胞和血小板适度降低，但对其他造血细胞影响不大。同时，基因敲除对人类和小鼠造血干/祖细胞（HSPC）的增殖和集落形成能力影响较小。研究者认为，与正常HSPC相比，LSC/LIC更依赖于METTL16的表达和功能。
3 METTL16对AML中的BCAA代谢进行重编程
那么，METTL16在AML中如何发挥致癌作用？研究人员首先通过突变体分析确定了METTL16的致癌作用完全取决于它在AML中的酶活。之后研究者又通过m6A-seq和RNA-seq来寻找METTL16的真正靶点。RNA-seq数据显示，METTL16敲除明显抑制了BCAT1、BCAT2、LARS1和IARS1的表达，RIP-qPCR数据也表明METTL16直接与AML细胞中的BCAT1、BCAT2、LARS1和IARS1转录本结合。
最近的研究表明，支链氨基酸（BCAA，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）的代谢与多种癌症的侵袭性相关，包括白血病，而以上四个基因都在BCAA生物合成中发挥作用，其中BCAT1和BCAT2属于支链氨基转移酶，催化了氨基从支链氨基酸到α-酮戊二酸的转移；LARS1是亮氨酰tRNA合成酶；IARS1是异亮氨酰tRNA合成酶。由此看来，METTL16在AML中的直接靶点是BCAA生物合成通路中的这四个关键基因。
考虑到BCAT1和BCAT2介导的BCAA分解代谢是大多数癌细胞中的主要反应，研究者将后续分析的重点放在这两个基因上。研究者发现，METTL16能够在体外直接使BCAT1和BCAT2 mRNA甲基化，而METTL16敲除显著降低了BCAT1和BCAT2转录本的稳定性并下调了它们的表达。同时，YTHDC1直接与BCAT1和BCAT2 mRNA相互作用并提高其稳定性（图2）。这些结果表明，METTL16在BCAT1和BCAT2转录本上形成m6A修饰，而YTHDC1识别这些m6A位点并提高这两个mRNA靶点的稳定性。
此外，Mettl16基因被敲除后，AML细胞的耗氧率（OCR）显著降低，而属于三羧酸循环的代谢物水平也显著降低，表明METTL16对BCAA的代谢进行了重编程。BCAT1和BCAT2的强制表达部分恢复了METTL16 KO诱导的AML细胞增殖缺陷和凋亡，且完全逆转了METTL16 KO诱导的氧化能力抑制，表明METTL16表达对代谢的影响主要是由于BCAT1和BCAT2的失调。这些结果显示，BCAT1和BCAT2是METTL16功能上的重要靶点，参与了METTL16在AML中的致癌作用。
研究结论
总的来说，这项研究描述了METTL16/m6A/BCAT1-2/BCAA轴在白血病发生中的作用，并强调了METTL16介导的m6A表观转录组和BCAA代谢重编程在白血病发生和LSC/LIC维持中的重要作用。作者认为，开发METTL16的小分子抑制剂有重要的转化/临床意义，并在AML治疗方面具有巨大潜力。
原文检索：
[1]Han L, Dong L, Leung K, et al. METTL16 drives leukemogenesis and leukemia stem cell self-renewal by reprogramming BCAA metabolism. Cell Stem Cell. 2023 Jan 5;30(1):52-68.e13. https://doi.org/10.1016/j.stem.2022.12.006
